Средство от бактериозов растений

Фитопатогенная микрофлора представлена двумя группами микроорганизмов: эукариотами (грибная микрофлора) и прокариотами (бактериальная микрофлора). Несмотря на глобальное преобладание видов грибных микроорганизмов над бактериальными, в последнее время все большую озабоченность вызывают болезни растений, вызванные именно бактериями.

Физиология развития и роста у бактерий и грибов различна

Факторы развития фитопатогенной микрофлоры в прикорневой зоне

Важными характеристиками колонизации ризосферы растения являются способность микроорганизмов к ориентации в прикорневой зоне и колонизация оптимальных зон для развития. Практически все грибы обладают способностью к направленному росту в сторону, наиболее благоприятную для этого. Положительными моментами следует признать увеличение концентрации субстрата или снижение концентрации ингибиторов, выделяющихся растением.

Иными словами, грибы всегда растут в сторону корня и (или) кислорода из воздуха. Линейная скорость ориентированного роста грибов может достигать нескольких миллиметров в сутки, а рассчитанный нами градиент концентраций, на который они способны реагировать, может составлять микрограммы на длину мицелия. 

Бактерии обладают механизмом хемотаксиса, движения в наиболее благоприятную для них сторону, за счет вращения жгутиков

Направленное движение у бактерий при этом затруднено броуновским движением, а самое главное – отсутствием в грунте «свободной» (гравитационной) воды.

Расчетные данные по хемотаксису для бактерий показали, что с учетом фактора броуновского движения клетка перемещается в среднем на 20–30 собственных длин за сутки, что на порядки ниже скорости направленного роста грибов. Это еще один фактор, влияющий на формирование микробного ценоза в прикорневой зоне. «Свободная» вода в данном контексте – это вода, которая в данной системе не подвержена капиллярному эффекту. В воде, в которой могут свободно перемещаться микроорганизмы, и проходит растворение органических и неорганических компонентов.

Грибы, как правило, растут в капиллярной воде, а бактерии – в большей степени в гравитационной.

И это еще один фактор, определяющий формирование ризобиальной микрофлоры. Соотношение гравитационной и капиллярной воды в современных субстратах для гидропонного выращивания растений сдвинуто в сторону последней.

Состав ферментативных активностей литических ферментов как у грибов, так и у бактерий крайне разнообразен и во многом схож. Практически все почвенные микроорганизмы выделяют пектиназы, целлюлазы, амилазы, протеиназы и даже липазы, но в случае грибов выделение ферментов происходит, когда клетки сорбированы на поверхности (в том числе и корня), и, соответственно, эффективность взаимодействия одного из активных центров целлюлаз (центра связывания с субстратом) в этом случае выше, чем у фермента, секретируемого в водный раствор, как для случая планктонных клеток.

Основной особенностью фитопатогенных грибов по отношению к объекту воздействия (растению) является наличие механизма синтеза низкомолекулярного небелкового токсина. 

Синтез токсина осуществляется грибами (на примере Fusarium oxysporum) на поздних стадиях своего развития, и его роль в общем метаболизме клеток не совсем ясна. Но низкомолекулярный токсин взаимодействует с корневой системой растения, подавляя или снижая его защитные функции. 

Для ризобиальных форм бактерий, в том числе и для фитопатогенных, пока нет четко установленных низкомолекулярных соединений, оказывающих токсическое действие на растение.

Комбинированное поражение растений фитопатогенными грибами и бактериями

Таким образом, общий анализ физиологии развития фитопатогенных форм грибов и бактерий указывает на то, что, скорее всего, бактериозы проявляются у растений только в том случае, если оно (растение) было атаковано фитопатогенным грибом и одновременно в него попали и фитопатогенные бактерии. 

При нахождении грибов и бактерий одновременно в растении их физиология развития различна: гриб продолжает ориентированный направленный рост по сосудам растения, а бактерии достаточно быстро разносятся по всему растению, при этом пектолитические ферменты бактерий способствуют этому.

 В соответствии с теорией фитопатогенеза, даже пораженное растение способно к выработке механизмов защиты и локализации грибных заболеваний, а вот бактериальные возбудители, которые распространились по всему растению, локализовать практически невозможно, хотя подавление их ферментов растению вполне по силам.

Таким образом, возможна и реализуется передача бактериальной инфекции через семена.

Применение химических фунгицидных препаратов только способствует распространению бактериозов, так как химические препараты, как правило, применяются по факту диагностики грибной инфекции.

Подавление бактериозов химическими обработками малоэффективно, так как данные методы не позволяют пролонгированно регулировать численность бактерий.

Защита растений от бактериозов

В связи с этим нами была поставлена задача разработки технологии биологической защиты против бактериозов на основе общей теории фитопатогенеза. Для этого мы постарались решить следующие вопросы:

1. Подобрать микроорганизмы, отвечающие следующим требованиям:
 

обладать способностью подавлять развитие фитопатогенных прокариотических микроорганизмов различной природы, как грамположительных, так грамотрицательных; должны не быть фототоксичными для растений на всех стадиях своего развития как в аэробных, так и анаэробных условиях; должны как можно дольше сохранять свои свойства в ризосфере защищаемых растений;
 не должны оказывать фунгицидного действия на агенты биологического контроля, в том числе Trichoderma viride.

2. Создать препарат на основе данных микроорганизмов.

3. Разработать технологию защиты от бактериозов.

Выбор микроорганизмов, обеспечивающих действенную защиту растениям

В качестве объекта исследований на основе литературных данных и собственных исследований, проведенных ранее, была выбрана группа молочнокислых микроорганизмов.

Антагонистическую активность по отношению к грамположительным и грамотрицательным микроорганизмам определяли методом «Диффузии в агар». Для этого на твердой агаризованной среде L-агар проделывали по четыре лунки на равном отдалении друг от друга кольцами Рашига. На поверхность агаризованной среды высевали газоном тест культуры – Agrobacterium sp., Erwinia sp., Pseudomonas sp., Bacillus sp. 

В лунки помещали культуральную жидкость c клетками исследуемых молочнокислых микроорганизмов объемом по 100 мкл, в остальные лунки помещали стерильную воду и антибиотик широкого спектра действия – амоксициллин в концентрации 0,1 г/мл в количестве 100 мкл, стерильным кольцом Рашига диаметром 7 мм делали лунки, в которые помещали суспензию исследуемого микроорганизма. 

По размерам зоны просветления определяли наличие способности к подавлению развития бактерий.

По результатам этих исследований была отобрана группа микроорганизмов, обладающая ярко выраженными антагонистическими свойствами.

Так как на синтез низкомолекулярных соединений у молочнокислых микроорганизмов существенную роль оказывает состав питательной среды, то аналогичные исследования были проведены на агаризованных средах, где в качестве источника углерода нами использовались органические соединения, моделирующие экссудаты, выделяемые огурцом, в концентрациях, близких к реальным. 

Часть исследуемых микроорганизмов проявила свойство подавления роста исследуемых бактерий и на средах с моделями экссудатов корневой системы. На рис. 1 представлены результаты подавления Agrobacterium sp.

Фитотоксичность препарата

Для проведения теста на фитотоксичность использовали стандартные методы по проращиванию семян огурца во влажной камере в присутствии суспензии исследуемых молочнокислых микроорганизмов. 

Результаты, представленные в табл. 1, показывают, что ни один из исследуемых микроорганизмов не оказывает фитотоксического действия на прорастание семян огурца.

Высевы с поверхности корневой системы проростков огурца доказывают, что молочнокислые микроорганизмы способны к росту на его поверхности, а следовательно, к метаболизму экссудатов, не оказывая отрицательного воздействия на развитие растения (рис. 2).

На этом этапе для дальнейшей работы был отобран один штамм микроорганизмов, обладающий наибольшей способностью к подавлению фитопатогенов.

Для проверки элиминирования молочнокислых микроорганизмов из ризосферы корневой системы огурца нами были проведены исследования, в ходе которых в растущие в торфяном субстрате огурцы однократно вносили суспензию молочнокислых микроорганизмов и далее в течение 2 месяцев отбирали пробы торфа из глубины горшков и анализировали в них наличие молочнокислых микроорганизмов. 

Результаты анализов, представленные в табл. 2, доказывают, что молочнокислые микроорганизмы, привнесенные в ризосферу корневой системы огурца, сохраняются как минимум 2 месяца.

Исследования взаимного влияния гриба Trichoderma viride и молочнокислых микроорганизмов проводили стандартными методами на стандартных средах и на средах, моделирующих экссудаты корневой системы огурца.

Как видно на рис. 3, два микроорганизма не оказывают отрицательного воздействия на развитие друг друга.

Средство биологической защиты растений от бактериозов

Результатом этого исследования стало создание препарата Бинал Экстра, в основе которого лежит идея по подавлению бактериальной микрофлоры в прикорневой зоне растения и замещению ее грибной микрофлорой.

Первые испытания препарата Бинал Экстра проводили при выращивании огурца сорта Кураж компании «Гавриш» в условиях защищенного грунта по малообъемной технологии на минеральной вате во втором обороте. Для избегания проникновения бактериальной микрофлоры при повреждении корневой системы при установке кубиков с рассадой на постоянное место низ кубиков обрабатывали рабочим раствором препарата Бинал Экстра. Технология обработки заключалась в кратковременном окунании кубика в раствор препарата на несколько секунд. При этом обработке подвергались те корешки, которые уже вышли из кубика. Всего было обработано порядка тысячи растений. Наблюдение в течение всего вегетационного периода за развитием растений показало, что ни одно из растений не подверглось заражению агробактериями. В это же время в контрольных вариантах наблюдались случаи поражения растений и симптомы развития «бешенства корней».

---

Бехбудзаде Нурлан Башир-оглы, аспирант кафедры биотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева


Шагаев Антон Александрович, аспирант, ведущий инженер кафедры биотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева

Минич Мария Владимировна, студентка кафедры биотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева


Журавлева Александра Сергеевна, студентка кафедры биотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева


Горюнова Ольга Борисовна, кандидат технических наук, генеральный директор ООО «БИОМ-ПРО»


Марквичев Николай Семенович, кандидат технических наук, доцент кафедры биотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева, заместитель генерального директора ООО «БИОМ-ПРО»